Métodos de Pesquisa em Neurociência - Cirurgia

Pesquisas sobre o sistema nervoso e o seu funcionamento, assim como de suas partes, envolvem a observação do comportamento de algum – no caso – animal que esteja com danos na área a ser observada. Esses danos são produzidos – geralmente - por meio de cirurgia.

Antes de dar inicio a cirurgia, usualmente drogas como ketamina e xilazina são utilizadas para promover um grau de inconsciência no animal, e depois anestesia-o com, por exemplo, xilocaína.

Para administrar fármacos a esses animais utiliza-se a técnica de canulação, que representa um único tubo para administração dessas drogas ou para conseguir amostras de sangue repetidamente, ao invés de diversas agulhas serem introduzidas no animal. A cânula é colocada na nuca, ou na base da cauda, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intravenosamente.

A maioria dos fármacos anestésicos e analgésicos estão disponíveis em alta concentração, então é necessária a diluição deles antes da aplicação.

A monitoração durante a anestesia deve ser constante. É importante monitorar temperatura, frequências respiratória e cardíaca. Em um estudo sobre a contribuição do hipocampo para a memória de reconhecimento, grupos de ratos passaram por um cirugia para provocar lesões na região do lobo medial temporal – onde se encontra o hipocampo.

Os animais são colocados em um equipamento Kopf para cirurgia estereotáxica, que é uma técnica minimamente invasiva que utiliza um sistema de coordenadas tridimensionais para localizar pequenos alvos onde alguma ação - como biópsia, estimulação – será realizada, no caso dos ratos, uma lesão. A cirurgia é iniciada quando os pontos bregma (encontro das suturas coronal e sagital) e lamba (encontro
das suturas sagital e lambdoide) estão no mesmo nível.

Na imagem acima, tem-se o mapeamento do cérebro do animal. A régua vertical é medida de 0 a 10 mm; a régua horizontal começa em 8, descresce até 0 e sobe até 8 novamente. 

Assim, mede-se o bregma e usa-o para encontrar o hipocampo. No caso, a área que se atinge com a cânula para chegar ao hipocampo esta aproximadamente 0,28 centímetros a esquerda do bregma, e a outra cânula será inserida a aproximadamente 0,28 centímetros a direita do bregma, inserindo - nos dois lados - até 0,27 centímetros abaixo do bregma. 

As lesões são feitas utilizando ácido ibotênico – uma neurotoxina que destrói os corpos celulares, mas não danifica as fibras de passagem – ou por radiofrequência – que destrói corpos celulares e as fibras de passagem.

Os ratos foram dividos em grupos com: 1) lesões no hipocampo por radiofrequência; 2) lesões no hipocampo por ácido ibotênico; 3)lesões na fimbria (região de matéria branca na região medial do hipocampo) e no fornix (conjunto de fibras que carregam sinais do hipocampo para o hipotálamo) por radiofrequência. Havia também dois grupos de controle: 4) com lesões na região dorsal ao hipocampo por ácido ibotênico e 5) que passou pelos procedimento cirúrgico, mas não sofreu lesões.

O osso acima da região alvo era retirado utilizando uma broca de alta velocidade. Depois que as lesões eram finalizadas (com exceção do grupo 5), as incisões eram fechadas. Os teste de comportamento eram iniciados duas semanas após a cirurgia.

Nos grupos com lesões por acido ibotênico (2 e 4), esse ácido era dissolvido e injetado usando uma seringa segura no equipamento estereotáxico. A agulha da seringa descia até a superfície da dura mater e uma pequena punção na dura era realizada. Quando atingia o alvo permanecia nele por 1 minuto antes da injeção. Após a injeção, a agulha permanecia ainda por 2 minutos para reduzir a volta do ácido pela agulha.

No grupo 2, o ácido ibotênico foi injetado em 18 áreas em cada lado do cérebro, com o objetivo de atingir o hipocampo. No grupo 4, o ácido foi injetado em nove áreas de cada lado do cérebro, para atingir a região imediatamente dorsal do hipocampo.

Nos grupos 1 e 3, as lesões eram provocadas por um eletrodo de radiofrequência e um gerador. O eletrodo descia até a superfície da dura mater e uma pequena punção era realizada nela logo abaixo do eletrodo. Quando atingia o alvo, o eletrodo era deixado lá por 1 minuto até aquecer o tecido a uma temperatura 80-90ºC.

Logo, a corrente era desligada e o eletrodo removido até que a temperatura abaixasse para 41oC. No grupo 1, as lesões foram provocadas em 12 regiões de cada lado do cérebro para danificar as partes dorsal e ventral do hipocampo. No grupo 3, cinco lesões foram provocadas – quatro lateralmente e uma na linha média – para atingir a linha medial do fornix e porções da fimbria.

Após o procedimento anestésico é importante o monitoramento do animal até sua total recuperação assim como o controle da temperatura e a utilização de analgésicos no período pósoperatório.Recuperações prolongadas podem estar relacionadas com hipotermia, hipoglicemia ou overdose de anestésicos.

(Impaired Recognition Memory in Rats after Damage to the Hippocampus; Robert E. Clark, Stuart M. Zola, and Larry R. Squire; The Journal of Neuroscience, December 1, 2000, 20(23):
8853–8860)