Métodos de Pesquisa em Neurociência - Camundongos Transgênicos e Nocautes

Nas últimas descadas, ratos e camundongos transgênicos e nocautes foram desnvolvidos para – por exemplo – o estudo da importância da regulação do estresse oxidativo para o funcionamento do SNC. Esses animais que apresentam alterações em genes envolvidos com a defesa antioxidante possibilita o estudo sobre essas proteínas no controle oxidativo do sistema nervoso.

Mas como se consegue esses ratos e camundongos transgênicos e nocautes?

O método mais comum é a injeção direta do gene de interesse no pró-núcleo de ovos fertilizados, a partir de uma micropipeta contendo a solução de DNA (~ 2 pmol). Os embriões são cultivados e reimplantados em uma fêmea. No Maximo 40% dos filhotes receberam o gene de interesse e são identificados por “Southern Blot” : o DNA é extraído e fragmentado, esses fragmentos de DNA são separados por eletroforese em gel, tranferidos para uma membrana, e o gene de interesse é identificado por uma sonda marcada de RNA ou DNA complementar.

O DNA do gene de interesse deve estar acompanhado de um promotor para uma expressão eficiente.

Os vírus também podem ser usados na tarefa de carregar o DNA para dentro da célula. Os retrovírus são os mais adequados para uma transformação estável de células de mamífero, já que o DNA viral é integrado no genoma da célula e não provoca a lise da mesma.

Dessa forma, é possível a transferência direta de um gene a uma região selecionada do cérebro ou a um tipo especifico de neurônio de camundongos, e permite induzir a expressão do gene em qualquer momento durante o desenvolvimento do sistema nervoso ou no animal completamente maduro.

O nocaute, propriamente dito, é a interrupção do gene in vitro provocada por mutações, deleções ou inserção de um fragmento de DNA, o qual interfere na fase de leitura, resultando em uma proteína não funcional.

O gene mutante é inserido em um vetor e introduzido em células tronco embrionárias em cultura por microinjeção, transfecção (método não-viral) ou eletroporação (aumento da permeabilidade da membrana da célula causado por um campo elétrico aplicado externamete).  

Recombinações que resultam na substituição do gene normal ocorrem cerca de uma em cem vezes. As células recombinantes são selecionadas e injetadas em um blastocisto, que é introduzido em uma fêmea.

Algumas das células do filhote possuirão o gene mutante. Se forem células germinativas, o cruzamento deste camundongo com outro resultará em filhotes heterozigotos, ou seja, expressando 50% da proteína. Cruzando esses heterozigotos entre si, obtêm-se animais homozigotos (com 25% da frequência), com as duas cópias do gene mutada, ou seja, com expressão nula da proteína.

Bibliografia: www.scielo.br/pdf/qn/v29n6/33.pdf ; livro: Imunologia Celular e Molecular, Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman.